慢病毒整合位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用現(xiàn)狀與創(chuàng)新

發(fā)布時間:2025/07/29分類:技術(shù)文章來源:科佰生物

在 CAR-T 細(xì)胞療法等基因治療領(lǐng)域，慢病毒載體的整合位點(diǎn)檢測是保障臨床安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。慢病毒載體在將治療性基因?qū)爰?xì)胞時，可能隨機(jī)整合到宿主基因組中，存在插入突變風(fēng)險，若整合到原癌基因附近，可能誘發(fā)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化；若整合到抑癌基因內(nèi)，可能導(dǎo)致其功能失活。因此，F(xiàn)DA、CDE 等監(jiān)管機(jī)構(gòu)明確要求對慢病毒整合位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)檢測與風(fēng)險評估。

FDA《嵌合抗原受體（CAR）T 細(xì)胞治療的研發(fā)考量》明確推薦對整合載體產(chǎn)品進(jìn)行長期隨訪，因整合可能增加延遲不良事件風(fēng)險;《基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品非臨床研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》將“插入突變風(fēng)險評估” 列為非臨床安全性研究的必檢內(nèi)容;《免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》明確要求檢測基因插入位點(diǎn)和拷貝數(shù)，評估其與安全性和療效的相關(guān)性。

慢病毒整合位點(diǎn)檢測方法

目前檢測慢病毒整合位點(diǎn)的主要平臺為高深度測序（NGS)。

Table 1. 主流的慢病毒整合位點(diǎn)檢測方法比較

標(biāo)準(zhǔn)化的整合位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品不僅能校準(zhǔn)檢測方法的靈敏度與準(zhǔn)確性，還能為不同實驗室的數(shù)據(jù)比對、方法驗證提供“通用標(biāo)尺”。在進(jìn)行方法學(xué)開發(fā)、性能驗證、試劑盒開發(fā)、日常檢測質(zhì)控中都需要使用標(biāo)準(zhǔn)品。

NIBSC WHO標(biāo)準(zhǔn)品（18/144）

目前商業(yè)化常見的慢病毒整合位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品為NIBSC WHO 標(biāo)準(zhǔn)品（18/144），它由NIBSC制備并發(fā)起，聯(lián)合全球13個國家的31家實驗室檢測的結(jié)果，確定該標(biāo)準(zhǔn)品包含共計10個慢病毒已知整合位點(diǎn)，分布在10條不同的染色體上，該產(chǎn)品面世以來已被眾多國內(nèi)外檢測機(jī)構(gòu)用于慢病毒整合位點(diǎn)檢測項目的性能驗證及臨床檢測應(yīng)用中的質(zhì)控。盡管如此該產(chǎn)品在實際應(yīng)用過程中仍存在一些短板和痛點(diǎn),其中包括：

該產(chǎn)品選取公布的位點(diǎn)信息僅來自于31家實驗室大多數(shù)獲得的較為一致的結(jié)果，不排除有一些潛在的未被公布，對一些復(fù)雜的非典型的整合和插入方式（例如一端或部分LTR發(fā)生缺失的整合位點(diǎn)）可能存在漏報；

該產(chǎn)品的參數(shù)來自于多家檢測機(jī)構(gòu)檢測結(jié)果的綜合和篩選，方法學(xué)上并未明確和統(tǒng)一，也并未就相應(yīng)的位點(diǎn)進(jìn)一步進(jìn)行驗證性實驗；

該產(chǎn)品只公布了整合位點(diǎn)的染色體位置，而沒有明確插入位置兩端的確切拼接序列，沒有完整精確呈現(xiàn)各位點(diǎn)的插入情況；

該產(chǎn)品并未提供整合位點(diǎn)的位點(diǎn)頻率數(shù)據(jù)，只能作為定性參考品使用，不能直接用于準(zhǔn)確性，精密度，檢測下限等相關(guān)性能驗證；

該產(chǎn)品經(jīng)我們驗證是來自于一個單克隆的核酸樣本，而目前臨床上需要檢測整合位點(diǎn)的CAR-T樣本多為多克隆樣本。單克隆與多克隆樣本相比存在整合位點(diǎn)較為單一，位點(diǎn)頻率較高容易檢出等特點(diǎn)，因此對應(yīng)臨床上大量多克隆樣品，整合位點(diǎn)繁多且低頻的特點(diǎn)，該產(chǎn)品并不能很好的模擬實際樣本的檢測。

科佰生物自主開發(fā)

針對上述痛點(diǎn)和缺陷，科佰生物自主開發(fā)了新一代的慢病毒整合位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品，該產(chǎn)品通過整合關(guān)聯(lián)擴(kuò)增技術(shù)（IAA）以及常用的靶向捕獲技術(shù)和LAM-PCR三種方式結(jié)合NGS發(fā)現(xiàn)并驗證標(biāo)準(zhǔn)品的整合位點(diǎn)，最大程度地保證了標(biāo)準(zhǔn)品中所有整合位點(diǎn)的準(zhǔn)確完整報道，進(jìn)一步結(jié)合了一代（Sanger）測序和數(shù)字PCR，精確定性和定量了所有整合位點(diǎn)的序列及頻率信息，做到了五重驗證。

另外為了進(jìn)一步滿足CAR-T細(xì)胞整合位點(diǎn)的臨床檢測需求，模擬臨床的實際情況。我們采用了T細(xì)胞來源的細(xì)胞系制備該標(biāo)準(zhǔn)品，并且除了單克隆樣品，還制備了特定低頻（位點(diǎn)頻率低至2%）的多克隆樣本，且包含位點(diǎn)更多，覆蓋的染色體條數(shù)和區(qū)域更廣，可直接用于檢測方法的性能驗證，確定方法精密度，準(zhǔn)確性，檢測限等指標(biāo)，也更貼合臨床檢測中的實際情況。

兩種標(biāo)準(zhǔn)品的對比分析

科佰生物產(chǎn)品特點(diǎn)

高度模擬臨床樣本

T細(xì)胞來源系作為宿主，更貼近CAR-T治療的實際場景。通過單克隆+多克隆標(biāo)準(zhǔn)品的設(shè)置，模擬隨機(jī)整合和多克隆多位點(diǎn)低頻的復(fù)雜性。

多重技術(shù)驗證體系

五步正交驗證（NGS（整合關(guān)聯(lián)擴(kuò)增技術(shù)（IAA，靶向捕獲， LAM-PCR）+ Sanger確認(rèn) + dPCR定量），確保位點(diǎn)序列與頻率的準(zhǔn)確性。在驗證LTR整合基因組位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗證了載體上其他基因序列在基因組上的非典型整合位點(diǎn)。

靈活的頻率梯度設(shè)計

可提供 5%和2%低頻整合樣本，滿足FDA對插入突變風(fēng)險評估的靈敏度需求。

標(biāo)準(zhǔn)化與可擴(kuò)展性

單克隆樣本可作為“標(biāo)準(zhǔn)模塊”，按需混合生成多克隆標(biāo)準(zhǔn)品，適應(yīng)不同檢測需求。

慢病毒整合位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品

針對這一要求，科佰生物推出多款慢病毒整合位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品。

貨號	名稱
CBPL0002	Lentiviral Vector Integration Site Reference Standard
CBPL0003	Lentiviral Vector Integration Site Reference Standard II (Single site)
CBPL0005	慢病毒整合位點(diǎn)分析參考試劑IV (含有性染色體插入)
CBPL0006	慢病毒整合位點(diǎn)分析陰性參考試劑
CBPL0007	慢病毒多克隆多整合位點(diǎn)參考品-5%
CBPL0008	慢病毒多克隆多整合位點(diǎn)參考品-2%